拉里·达利（本·斯蒂勒饰）的生活正陷入低谷：工作频繁更换，四处漂泊；妻子已经与他离婚，并找了一位证券经纪人，眼看就要再婚，而他在儿子心中的地位也越来越不稳。为了重新掌控生活、争取儿子的抚养权，拉里只好暂时放下“干一番大事业”的梦想，接受了纽约自然博物馆夜间警卫的工作。
他原以为这只是份枯燥乏味的差事，没想到上班第一晚，博物馆便发生了匪夷所思的变化。原来，馆内的法老金牌蕴藏着神奇力量，每当夜幕降临，所有展品和标本都会活过来：追逐骨头的霸王龙、调皮捣蛋的猴子、凶悍的匈奴王，还有尝试钻木取火的穴居人，全都让博物馆陷入混乱。幸好，在第26任总统特迪·罗斯福的帮助下，拉里总算勉强控制住局面。然而新的危机随即出现，有人打起了法老金牌的主意。为了履行自己的职责，也为了守护博物馆夜晚的奇迹，拉里不得不勇敢站出来。
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